MICROSCOPI OTTICI

1 Dicembre 2008

Il microscopio ottico è il più semplice. Per mezzo di lenti ingrandisce l'immagine del campione, illuminato con luce nell'intervallo spettrale del visibile.
Può essere semplice (un solo sistema di lenti o addirittura una sola lente) o composto (almeno due sistemi, oculare ed obiettivo), e l'illuminazione può raggiungere il campione da dietro, attraversandolo (luce trasmessa), o esserne riflessa (luce riflessa). Il microscopio ottico permette di avere immagini di soggetti dimensionalmente collocati all'incirca tra il millimetro ed il micrometro, anche di esseri viventi. I primi esempi di ingrandimento ottico datano migliaia di anni e risalgono alle civiltà mesopotamiche. Nel 1648 Antoni van Leeuwenhoek osservò e descrisse numerosi microorganismi, utilizzando un microscopio semplice, inizialmente dotato di pochi ingrandimenti e poi perfezionato fino a raggiungerne alcune centinaia (275 accertati, 500 ipotizzati). Nel 1665 Robert Hooke, utilizzando una forma molto rudimentale di microscopio ottico composto, con un limitato potere di ingrandimento ed osservando il sughero vide e descrisse per la prima volta la struttura cellulare propria di tutti i viventi.

Microscopio semplice a luce trasmessa

Come nei primi esemplari di van Leeuwenhoek si tratta di una semplice lente o sistema di lenti (un doppietto frequentemente) con una serie di supporti per il campione ed un sistema elementare di spostamento dell'ottica per la messa a fuoco.

Microscopio semplice a luce riflessa

Come il precedente, l'illuminazione in questo caso è frontale o laterale, il caso tipico è la lente contafili in uso in filatelia e nel controllo dei filati dell'industria tessile.

Microscopio composto a luce trasmessa

È un microscopio che, per vedere i particolari del campione utilizza luce trasmessa attraverso lo stesso, proveniente da una piccola lampadina incorporata, o indirizzata tramite uno specchio da una sorgente esterna (nei primi esemplari storici luce diurna o luce proveniente da una candela o lampada ad olio). Negli esemplari di uso corrente la sorgente più convenientemente utilizzata è una lampada alogena. Da notare che nei microscopi composti, in genere senza particolari accorgimenti l'immagine osservata risulta invertita.

Microscopio composto a luce riflessa

Come il precedente, l'illuminazione in questo caso proviene dall'alto, tramite diversi sistemi. Focalizzazione della sorgente tramite specchi, sistemi a fibre ottiche, LED, epi-illuminazione (che sfrutta lo stesso obiettivo anche per illuminare il campione).

Stereomicroscopi

Microscopio che si avvale in realtà di due diversi e distinti microscopi, in generale composti ed a basso ingrandimento, formanti tra loro un certo angolo. L'osservazione produce un'immagine tridimensionale, come la visione diretta, eliminando l'effetto di appiattimento tipico degli altri tipi di microscopi. In genere sono dotati di un sistema di prismi ottici per il raddrizzamento dell'immagine, e quindi l'eventuale manipolazione corretta del campione. Sono per questo utilizzati nell'industria (micro componentistica), nella dissezione, e nella micro chirurgia.

Microscopio a fluorescenza

Strutturalmente esisterebbero sistemi a luce trasmessa e riflessa, ma per motivi tecnici i primi sono stati relegati ad usi limitati, su campioni opachi. La maggior parte della produzione ed uso prevede sistemi ad epifluorescenza. Questo tipo di microscopio serve per osservare preparati naturalmente fluorescenti, o legati con molecole fluorescenti o rese tali da particolari coloranti detti fluorocromi. Questi composti vanno selettivamente a legarsi con strutture cellulari definite.
La sorgente luminosa (alogena di alta potenza, lampada di wood, lampada ad arco e scarica di gas e più recentemente diodi LED ad alta efficienza e laser), che trasmette radiazioni ultraviolette, o comunque di bassa lunghezza d'onda nel visibile, eccita il preparato generalmente dall'alto (sistemi ad epifluorescenza). Le componenti del preparato emettono luce di lunghezza d'onda maggiore di quella emessa dalla sorgente luminosa. Questo fenomeno è conosciuto come fluorescenza.
Attualmente gli utilizzi più diffusi prevedono l'utilizzo di anticorpi specifici, appositamente prodotti per andare a legarsi con determinate molecole nel campione (che rappresentano l'antigene) utilizzando fluoresceina, rodamina, ed altre simili molecole come fluorocromo legato all'anticorpo per renderlo appunto fluorescente e visibile. Nell'osservazione è fondamentale l'utilizzo corretto dei filtri ottici per selezionare la giusta lunghezza d'onda di eccitazione, la giusta lunghezza d'onda di emissione visibile, e l'arresto della radiazione ultravioletta che danneggerebbe l'occhio dell'osservatore. Gli obiettivi microscopici usati per questo tipo di osservazione non devono contenere lenti che presentino fenomeni di autofluorescenza (come spesso succede per quelli alla fluorite), devono trasmettere l'ultravioletto (se in epifluorescenza, visto che l'illuminazione passa attraverso l'obiettivo), mente il grado di correzione cromatico è poco influente sulla qualità dell'immagine, per cui vanno generalmente bene le ottiche acromatiche.

Microscopio a contrasto di fase

È un tipo particolare di microscopio che analogamente al microscopio a luce trasmessa lavora nel campo del visibile. Si basa sul fenomeno dell'interferenza luminosa.
Il preparato viene illuminato da un fascio luminoso in realtà suddiviso a livello del condensatore in due porzioni di fase differente e con diverso angolo di incidenza. Il cambiamento ulteriore di fase dovuto alla porzione di luce che attraversa il campione, andandosi a ricombinare con la luce non rifratta renderà visibili componenti trasparenti ma di indice di rifrazione differente da quello del mezzo. In campo biologico, la maggior parte dei componenti cellulari è trasparente alla luce visibile, anche a causa dell'elevata presenza di acqua, tuttavia vediamo che le radiazioni luminose una volta oltrepassata una componente o un organello cellulare, subiscono dei cambiamenti di fase che dipendono sia dallo spessore, sia dal diverso indice di rifrazione della struttura oltrepassata. Mediante il microscopio a contrasto di fase è possibile andare a determinare tali cambiamenti e convertirli in differenze di densità così da ottenere delle informazioni utili circa la composizione di cellule e tessuti analizzati. Questa tecnica di microscopia è molto utilizzata per andare ad osservare le cellule mantenute in vita in apposite colture in vitro; infatti tramite la microscopia a contrasto di fase si evita l'utilizzo di coloranti e fissativi che spesso comportano notevoli alterazioni strutturali ottenendo così dei dati molto più reali di quella che è l'organizzazione cellulare. La tecnica in questione fu messa a punto dal fisico olandese Frederik Zernike (Frits Zernike) negli anni '50 e gli valse il Premio Nobel per la fisica nel 1953.

Microscopio a contrasto interferenziale

Analogamente al contrasto di fase è utilizzato per osservare strutture trasparenti non altrimenti visibili in campo chiaro. Combina effetti di interferenza e di polarizzazione e fornisce immagini più contrastate e con un effetto di tipo tridimensionale. Questo metodo di contrasto è conosciuto anche con il nome di "DIC" (differential interference contrast). Una delle due tecnologie più utilizzate è la Nomarski, dal nome dell'inventore della configurazione ottica che si ritrova in diffusi microscopi odierni a contrasto interferenziale.

Microscopio ad interferenza

Si attua con due treni di onde completamente separate e tramite due diversi percorsi ottici: uno attraversa il preparato che lo sfasa, indi si incontra con il secondo non sfasato, dando luogo a fenomeni di interferenza. Queste forniscono notizie utili, anche quantitative, sui componenti presenti nel campione.

Microscopio Leica DMRX a luce incidente con componenti meccaniche e contatore automatico di punti Swift F per l'analisi della composizione organica di campioni di roccia e carbone.

Microscopio polarizzatore

Il microscopio polarizzatore sfrutta un fascio di luce polarizzata di dato orientamento che attraversa il corpo del preparato, posto su un tavolino rotante, per venire poi analizzato da un secondo filtro polarizzatore, anch'esso orientabile e in genere posto sul piano posteriore dell'obiettivo. Questo tipo di microscopio è molto utilizzato in petrografia, cioè nello studio delle rocce e dei minerali che le compongono. La microscopia in luce polarizzata utilizza onde ciascuna delle quali oscilla in un piano, detto piano di vibrazione o piano di polarizzazione che è perpendicolare alla direzione di propagazione dell’onda stessa. In un raggio di luce normale le onde oscillano in tutti i possibili piani. Definiamo polarizzato un raggio di luce formato da onde i cui piani di vibrazione sono tutti orientati in un’unica direzione, sono cioè paralleli fra loro.

Ultramicroscopio

L'ultramicroscopio ed il microscopio in campo oscuro, sono microscopi ottici con un condensatore paraboloide, con pareti a specchio, o comunque munito di uno schermo anulare che ferma i raggi che illuminerebbero direttamente il preparato. Vengono raccolti dall'obiettivo solo i raggi che vengono opportunamente deviati (rifratti) oppure diffratti. La diffrazione (deviazione dei fotoni a onde decrescenti rispetto alla traiettoria principale) viene operata da particelle del preparato che abbiano dimensioni submicroscopiche comprese fra 0,1 micrometro e 1 nanometro, particelle che, pur sotto la soglia di risoluzione del microscopio, appariranno come punti luminosi su sfondo buio, senza dettagli morfologici (effetto Tyndall).

Microscopio confocale

Immagine al confocale. La tubulina di alcune cellule di endotelio colorata in verde da anticorpi coniugati alla fluoresceina, la actina colorata da Texas red coniugato alla falloidina in rosso, ed il dna colorato in azzurro dal DAPI

Il Microscopio confocale si basa su una tecnologia ottica volta ad accrescere sensibilmente la risoluzione spaziale del campione, eliminando gli aloni dovuti alla luce diffusa dai piani fuori fuoco del preparato. Esistono diverse tecniche per ottenere questo risultato: a disco rotante (Nipkow disk), Programmable Array Microscopes (PAM), e laser. Quest'ultimo tipo, il più diffuso e denominato CLSM, acronimo di confocal laser scanning microscope, è un evoluto microscopio a fluorescenza che permette di focalizzare con estrema precisione un laser sul preparato, aumentando notevolmente la risoluzione e la profondità di campo. La sua sorgente luminosa è costituita uno o più laser, generalmente a semiconduttore, per ogni diversa frequenza d'eccitazione. Il meccanismo di direzione del fascio luminoso viene gestito da sistemi computerizzati. Le immagini ottenute, sincronizzando col fascio di eccitazione il dispositivo di rivelazione, sono particolarmente definite e spettacolari, e possono permettere di evidenziare in diversi colori diverse molecole presenti nel preparato, permettendone di apprezzarne la tridimensionalità (esempio actina in rosso tubulina del citoscheletro in verde e dna del nucleo in blu).

Microscopio nell'ultravioletto

Come si vedrà meglio nella descrizione del SNOM Il limite principale della microscopia ottica sta nella risoluzione massima, strettamente legata al fenomeno della diffrazione. Il criterio di Abbe limita la risoluzione massima a circa 0.5 λ/(n sin θ) per un sistema ottico avente apertura numerica n sin θ, che impieghi luce di lunghezza d’onda λ. Per luce nello spettro visibile essa si attesta circa a 0.2 µm, dati i limiti teorici imposti dalla massima apertura numerica di una lente. Un sistema per superare il limite è spostarsi su lunghezze d'onda nello spettro appartenente all'ultravioletto. Si riesce così ad incrementare notevolmente la risoluzione, ma i problemi tecnici derivanti dalla non visibilità dell'ultravioletto (occorrono schermi fluorescenti o la fotografia dell'immagine), alla trasparenza delle ottiche (in quarzo), ed alla dannosità della radiazione per gli organismi viventi, con l'avvento dei microscopi elettronici a basso costo hanno limitato molto ulteriori sviluppi di questo strumento

Microscopio a raggi X

Tale microscopio è basato sull'emissione di radiazioni a raggi X. Viene utilizzato per studiare le strutture di particolari molecole o ioni presenti all'interno della cellula. Quando i raggi emessi attraversano le strutture cellulari subiscono delle diffrazioni che verranno impressionate su una lastra fotografica, apparendo come delle sfocate bande concentriche. Dalla differente disposizione di tali bande si potrà determinare la distribuzione atomica delle molecole all'interno dei tessuti analizzati.

MICROSCOPIO BIOLOGICO

La Biologa è quella materia che studia tutto ciò che riguarda la vita.

Il microscopio biologico può avere una testa monoculare o binoculare. E' caratterizzato da un elevato potere di ingrandimento ed è usato per osservare vetrini preparati, organi o sezioni di tessuti, su una superficie di vetro illuminata. Questo tipo di microscopio ha una sorgente di luce incidente, che proviene dal basso, o uno specchio per concentrare la luce solare. Il microscopio stereoscopico è invece sempre binoculare e offre una visione tridimensionale. Ha un basso potere di ingrandimento, così è impiegato per osservare corpi solidi e opachi, come minerali, vegetali, insetti etc. Prima di acquistare un microscopio è importante tenere a mente le seguenti caratteristiche:

- INGRANDIMENTO: il prodotto tra l'ingrandimento dell'oculare e l'ingrandimento dell'obiettivo dà il potere di ingrandimento totale. Al crescere dell'ingrandimento decresce il campo visibile.

- ILLUMINAZIONE: può essere o a luce incidente, ovvero dal basso e particolarmente utile nei microscopi biologici, oppure luce trasmessa, quindi dall'alto, più utile per i microscopi stereoscopici. Alcuni modelli di stereoscopici hanno entrambi i tipi di illuminazione.

A seconda delle necessità del cliente, al fine di abbassare o accrescere l'ingrandimento fornito, potrebbe essere necessario acquistare a parte oculari e/o obiettivi.
In un microscopio biologico, quando non è incluso, può essere utile un piccolo tavolo traslatore (uno strumento dalla forma squadrata che consente piccolissimi movimenti del piano di vetro) e una luce per fornire la necessaria illuminazione nell'osservazione dei vetrini preparati.
Uno speciale oculare micrometrico graduato, può essere altrettanto utile, così da misurare con precisione le dimensioni dei preparati.

MICROSCOPIO GEOLOGICO

Per lo studio della geologia viene utilizzato un microscopio polarizzatore, definito nello specifico come microscopio ottico polarizzatore a luce trasmessa, e detto anche microscopio da petrografia. È sostanzialmente simile ad un normale microscopio, differendo da esso per alcune caratteristiche che indirizzano le sue proprietà verso settori particolareggiati dell'analisi microscopica, in particolare per la mineralogia, nel qual caso si riesce a raccogliere dei dati univoci e oggettivi per il riconoscimento del minerale (grazie all'utilizzo di luce polarizzata).

Ciò che realmente distingue un microscopio ottico da quello polarizzante è:

• la presenza di un polarizzatore: filtro posto tra sorgente luminosa e tavolino portaoggetti (in molti casi attivabile o disattivabile tramite una apposita leva o per estrazione), che converte la luce da “parallela” a polarizzata; vengono usati a questo scopo dei filtri Polaroid; la sua presenza è essenziale poiché se il raggio luminoso incidente sul campione da analizzare non fosse polarizzato, si avrebbe un fascio vibrante in tutte le direzioni dello spazio che colpirebbe il campione in moltissime differenti direzioni, rendendo impossibile una analisi oggettiva e producendo una visione poco chiara e di nessun valore scientifico.

• la presenza di un analizzatore: filtro posto tra gli/lo obiettivi/o e l'oculare; la sua attivazione in contemporanea con il filtro polarizzatore porta alla cosiddetta condizione di estinzione, ovvero all'annullamento del raggio luminoso incidente (a causa dell'azione polarizzante perpendicolare dell'analizzatore rispetto al polarizzatore). La figura di estinzione è visibile nell'oculare completamente nera, e soltanto nel caso in cui si stia effettuando un'analisi a nicol incrociati.

• il tavolino portaoggetti rotante e graduato (utile per ruotare i campioni osservandoli con diverse angolazioni della luce incidente), spesso graduato nel suo perimetro, permette anche di effettuare misurazioni di vario tipo sul campione.

La mineralogia e la petrografia sono le due scienze che maggiormente si avvalgono di questo tipo di strumentazione. In questi ambiti, infatti, si riesce ad inquadrare alcune importante proprietà dei minerali, motivo per cui il microscopio polarizzante rimane ancora un mezzo privilegiato per effettuare e ricavare risultati che si otterrebbero altrimenti con analisi più complesse e costose. Si ricorda che, attualmente, mentre la mineralogia si avvale del microscopio polarizzante con scarsa frequenza (a causa della diffusione di mezzi più potenti, precisi e veloci di analisi), in petrografia questa tipologia di analisi è ancora basilare e consente di ottenere ottimi risultati.

In questo contesto, possono essere analizzati soltanto minerali (o in generale campioni) trasparenti, ovvero che si lasciano attraversare dalla luce. In caso contrario, minerali opachi creerebbero una figura completamente nera dovuta all'impossibilità di lasciarsi attraversare dalla luce (per questo tipo di minerali si ricorre allo studio con microscopi binoculari o con microscopi metallografici. È utile notare che la figura scura o nera che si forma in questi casi non si può definire come di “estinzione”.